HAT培養基助力雜交瘤細胞篩選

發布者:艾美捷科技發布時間:2020-12-02

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      1964年Littlefield首先發明了HAT(H-Hypoxanthine次黃嘌呤,A-Aminopterin氨基蝶呤,T--Thymidine 胸腺嘧啶核苷)培養基的選擇培養。

 

       HAT培養基是指含有次黃嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脫氧核苷(thymidin)三種物質的細胞培養基,說起HAT培養基,我們可能會想到這是用于雜交瘤細胞篩選的常用培養基。是的,首先給大家介紹一下細胞內DNA原料核苷酸的兩種主要合成途徑:

 

    (1)主要合成途徑:生物體內嘌呤核苷酸合成,首先由5-磷酸核糖焦磷酸合成次黃嘌呤核苷酸,次黃嘌呤核苷酸合成后,經氨基化即可形成腺嘌呤核苷酸;經氧化和氨基化即可形成鳥嘌呤核苷酸。再來看嘧啶核苷酸的合成,生物體內先先由氨甲酰磷酸和天冬氨酸合成尿嘧啶核苷酸,然后尿嘧啶核苷酸經磷酸化、氨基化就可形成胞嘧啶核苷三磷酸;在核糖核酸還原酶的還原作用下可形成尿嘧啶脫氧核糖核苷酸,再經過甲基化后可形成胸腺嘧啶核苷酸。

 

    (2)旁路合成途徑:利用次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)催化次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相應的核苷酸。

 

核酸合成主要途徑

 

      既然體內有兩條核酸合成途徑,那么我們是否可以抑制其中一條途徑然后利用另一條來進行篩選呢?科學先驅們想出了如下方法利用核酸的合成途徑來制備雜交瘤細胞生產單克隆抗體:

 

      將B細胞于腫瘤細胞進行融合培養后,在一款選擇培養基中添加某些物質來阻斷核酸的主要合成途徑,那么未融合的瘤細胞和自身融合的瘤細胞在篩選過程中就會死去,能存活下來的就只有能進行旁路途徑合成核酸的B細胞和瘤細胞的融合細胞了

 

核酸合成主要途徑

 

      根據這一設想,科學家們開發了HAT選擇性培養基,其中H代表次黃嘌呤,A代表氨基蝶呤,T代表胸腺嘧啶核苷酸。

 

       HAT選擇培養基篩選原理

 

      A—氨基蝶呤為葉酸的結構類似物,正是它阻斷了核酸合成的主要途徑,阻礙了次黃嘌呤核苷酸和胸腺嘧啶核苷酸的合成。H—次黃嘌呤,可經核酸合成旁路途徑合成次黃嘌呤核苷酸,從而完成嘌呤核苷酸的補救合成。T—胸腺嘧啶核苷酸,直接添加到培養基中來補足被阻斷的嘧啶核苷酸的合成。

 

HAT選擇培養基篩選原理

 

      HAT培養基是指將上述三種物質按照一定的配比合成的細胞培養基。再細胞合成DNA原理——各類核苷酸的時候,氨基蝶呤可阻礙主要合成途徑,所以培養基中含有它時,細胞便只能通過旁路合成途徑合成核苷酸或者額外供給核苷酸。至于缺失中間合成途徑的細胞,由于失去增殖能力逐漸死亡。根據這一點,不僅把混存于細胞群中的正常細胞,通過試管內培養進行選擇,例如嘌呤的中間合成途徑缺失株和嘧啶的中間合成途徑缺失株,由于可以互補,所以兩者的融合細胞,即使在氨基蝶呤的存在條件下也可以增殖。在這種情況下,利用HAT培養基可對融合細胞進行篩選,次黃嘌呤和胸腺嘧啶脫氧核苷可作為中間合成途徑的原料添加到培養基中。

 

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